Zmijski otrov sadrži enzime koji hidroliziraju karboksilne esterske veze.Supstrati za hidrolizu su fosfolipidi, acetilholin i aromatični acetat.Ovi enzimi uključuju tri vrste: fosfolipazu, acetilkolinesterazu i aromatičnu esterazu.Arginin esteraza u zmijskom otrovu također može hidrolizirati sintetički arginin ili lizin, ali uglavnom hidrolizira proteinske peptidne veze u prirodi, pa spada u proteazu.Enzimi o kojima se ovdje govori djeluju samo na esterske supstrate i ne mogu djelovati ni na jednu peptidnu vezu.Među ovim enzimima, biološke funkcije acetilholinesteraze i fosfolipaze su važnije i potpuno su proučavane.Neki zmijski otrovi imaju jaku aktivnost aromatične esteraze, koja može hidrolizirati p-nitrofenil etil ester, a- ili P-naftalen acetat i indol etil ester.Još uvijek nije poznato da li ovu aktivnost proizvodi nezavisni enzim ili poznata nuspojava karboksilesteraze, a kamoli njen biološki značaj.Kada je otrov Agkistrodon halys Japonicus reagovao sa p-nitrofenil etil esterom i indol etil esterom, hidrolizati p-nitrofenola i indol fenola nisu pronađeni;Naprotiv, ako ovi esteri reaguju sa zmijskim otrovom podvrste Zhoushan kobre i zmijskim otrovom Bungarus multicinctus, brzo će se hidrolizirati.Poznato je da ovi otrovi kobre imaju jaku aktivnost holinesteraze, koja može biti odgovorna za hidrolizu gore navedenih supstrata.U stvari, Mclean et al.(1971) izvještavaju da mnogi zmijski otrovi koji pripadaju porodici Cobra mogu hidrolizirati indol etil ester, naftalen etil ester i butil naftalen ester.Ovi zmijski otrovi potiču od: kobre, crnovratne kobre, crne usne kobre, zlatne kobre, egipatske kobre, kraljevske kobre, zlatne kobre mambe, crne mambe i mambe bijele usne (D. aw još uvijek poznaje istočnu rombolu zvečarku
Zmijski otrov može hidrolizirati metil indol etil ester, koji je supstrat za određivanje aktivnosti kolinesteraze u serumu, ali ovaj zmijski otrov ne pokazuje aktivnost holinesteraze.Ovo pokazuje da u otrovu kobre postoji nepoznata esteraza, koja se razlikuje od holinesteraze.Da bi se razumjela priroda ovog enzima, potreban je daljnji rad na odvajanju.
1、 Fosfolipaza A2
(I) Pregled
Fosfolipaza je enzim koji može hidrolizirati gliceril fosfat.U prirodi postoji 5 vrsta fosfolipaze, a to su fosfolipaza A2 i fosfolipaza
A., fosfolipaza B, fosfolipaza C i fosfolipaza D. Zmijski otrov uglavnom sadrži fosfolipazu A2 (PLA2), nekoliko zmijskih otrova sadrži fosfolipazu B, a druge fosfolipaze se uglavnom nalaze u životinjskim tkivima i bakterijama.Slika 3-11-4 prikazuje mjesto djelovanja ovih fosfolipaza na hidrolizu supstrata.
Među fosfolipazama, PLA2 je više proučavan.To je možda najviše proučavan enzim u zmijskom otrovu.Njegov supstrat je esterska veza na drugoj poziciji Sn-3-glicerofosfata.Ovaj enzim se široko nalazi u zmijskom otrovu, pčelinjem otrovu, otrovu škorpiona i životinjskim tkivima, a PLA2 obiluje u četiri familije zmijskih otrova.Budući da ovaj enzim razbija crvena krvna zrnca i uzrokuje hemolizu, naziva se i "hemolizin".Neki ljudi PLA2 nazivaju i hemolitičkom lecitinazom.
Ludeeke je prvi otkrio da zmijski otrov može proizvesti hemolitičko jedinjenje djelujući na lecitin putem enzima.Kasnije, Delezenne i dr.dokazao da kada otrov kobre djeluje na konjski serum ili žumance, stvara hemolitičku tvar.Sada je poznato da PLA2 može direktno djelovati na fosfolipide membrane eritrocita, uništavajući strukturu membrane eritrocita i izazivajući direktnu hemolizu;Također može djelovati na serum ili dodani lecitin kako bi proizveo hemolitički lecitin, koji djeluje na crvena krvna zrnca da bi proizveo indirektnu hemolizu.Iako PLA2 ima u izobilju u četiri porodice zmijskih otrova, sadržaj enzima u različitim zmijskim otrovima je malo drugačiji.Zvečarka (C
Zmijski otrov pokazao je samo slabu aktivnost PLA2.Tabela 3-11-11 ilustruje poređenje PLA2 aktivnosti 10 glavnih otrova zmija otrovnica u Kini.
Tabela 3-11-11 Poređenje aktivnosti fosfolipaze VIII 10 zmijskih otrova u Kini
Zmijski otrov
Oslobađanje masti
alifatska kiselina,
Cjumol/mg)
Hemolitička aktivnost CHU50/^ g * ml)
Zmijski otrov
Oslobađanje masnih kiselina
(^raol/mg)
Hemolitička aktivnost “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
jedanaest
Micracephal ophis
pet poena jedan nula
kalyspallas
8. 68
dve hiljade osam stotina
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tri poen osam dva
sto četrdeset
Bnugarus fasctatus
7,56
dvjesta osamdeset
B. multicinctus
jedan poen devet šest
dvjesta osamdeset
Viper a Russelli
sedam tačka nula tri
T, mucrosquamatus
jedan poen osam pet
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Odvajanje i prečišćavanje
Sadržaj PLA2 u zmijskom otrovu je velik, stabilan je na toplinu, kiselinu, alkalije i denaturans, tako da se PLA2 lako pročišćava i odvaja.Uobičajena metoda je da se prvo izvrši gel filtracija na sirovom otrovu, zatim se izvrši ionska izmjenjivačka hromatografija, a sljedeći korak se može ponoviti.Treba napomenuti da liofiliziranje PLA2 nakon jono-izmjenjivačke hromatografije ne bi trebalo uzrokovati agregaciju, jer proces sušenja zamrzavanjem često povećava ionsku snagu u sistemu, što je važan faktor koji uzrokuje agregaciju PLA2.Pored gore navedenih općih metoda, usvojene su i sljedeće metode: ① Wells et al.② Supstratni analog PLA2 je korišten kao ligand za afinitetnu hromatografiju.Ovaj ligand se može vezati za PLA2 u zmijskom otrovu sa Ca2+.EDTA se uglavnom koristi kao eluent.Nakon što se Ca2+ ukloni, afinitet između PLA2 i liganda se smanjuje i može se odvojiti od liganda.Drugi koriste 30% organski rastvor ili 6mol/L uree kao eluens.③ Hidrofobna hromatografija je izvedena sa PheiiylSephar0SeCL-4B da bi se uklonili tragovi PLA2 u kardiotoksinu.④ Anti PLA2 antitijelo je korišteno kao ligand za izvođenje afinitetne hromatografije na PLA2.
Do sada je pročišćen veliki broj zmijskog otrova PLAZ.Tu et al.(1977) naveo je PLA2 pročišćen od zmijskog otrova prije 1975. Posljednjih godina, veliki broj članaka o odvajanju i prečišćavanju PLA2 je objavljen svake godine.Ovdje se fokusiramo na odvajanje i pročišćavanje PLA od strane kineskih naučnika.
Chen Yuancong i dr.(1981) izdvojili su tri vrste PLA2 iz otrova Agkistrodon halys Pallas u Zhejiangu, koje se prema njihovim izoelektričnim tačkama mogu podijeliti na kisele, neutralne i alkalne PLA2.Prema svojoj toksičnosti, neutralni PLA2 je toksičniji, koji je identificiran kao presinaptički neurotoksin Agkistrodotoxin.Alkalni PLA2 je manje toksičan, a kiseli PLA2 gotovo da nema toksičnosti.Wu Xiangfu et al.(1984) uporedili su karakteristike tri PLA2, uključujući molekularnu težinu, sastav aminokiselina, N-terminal, izoelektričnu tačku, termičku stabilnost, aktivnost enzima, toksičnost i hemolitičku aktivnost.Rezultati su pokazali da imaju sličnu molekularnu težinu i termičku stabilnost, ali da imaju značajne razlike u drugim aspektima.U aspektu aktivnosti enzima, aktivnost kiselog enzima bila je veća od aktivnosti alkalnog enzima;Hemolitički učinak alkalnog enzima na crvena krvna zrnca pacova bio je najjači, zatim neutralni enzim, a kiseli enzim jedva hemoliziran.Stoga se spekuliše da je hemolitički efekat PLAZ-a povezan sa nabojem PLA2 molekula.Zhang Jingkang i dr.(1981) su napravili kristale agkistrodotoksina.Tu Guangliang et al.(1983) izvještavaju da je toksični PLA sa izoelektričnom točkom 7,6 izolovan i pročišćen iz otrova Vipera rotundus iz Fujiana, i njegovih fizičkih i hemijskih svojstava, sastava aminokiselina i sekvence od 22 aminokiselinska ostatka na N -terminala su utvrđeni.Li Yuesheng et al.(1985) izolovao je i pročistio još jedan PLA2 iz otrova Viper rotundus u Fujianu.Podjedinica PLA2* je 13 800, izoelektrična tačka je 10,4, a specifična aktivnost je 35/xnioI/miri mg。 Uz lecitin kao supstrat, optimalni pH enzima je 8,0, a optimalna temperatura je 65 °C. LD5 ubrizgan intravenozno kod miševa.To je 0,5 ± 0,12 mg/kg.Ovaj enzim ima očigledne antikoagulantne i hemolitičke efekte.Otrovni PLA2 molekul se sastoji od 123 ostatka 18 vrsta aminokiselina.Molekul je bogat cisteinom (14), asparaginskom kiselinom (14) i glicinom (12), ali sadrži samo jedan metionin, a njegov N-terminal je serinski ostatak.U poređenju sa PLA2 koji je izolovao Tuguang, molekularna težina i broj aminokiselinskih ostataka dva izoenzima su vrlo slični, a sastav aminokiselina je takođe vrlo sličan, ali je broj ostataka asparaginske kiseline i prolina nešto drugačiji.Otrov zmije kraljevske kobre Guangxi sadrži bogat PLA2.Shu Yuyan i dr.(1989) izolovao je PLA2 iz otrova, koji ima specifičnu aktivnost 3,6 puta veću od originalnog otrova, molekulsku težinu od 13000, sastav od 122 aminokiselinska ostatka, izoelektričnu tačku od 8,9 i dobru termičku stabilnost.Iz posmatranja efekta bazičnog PLA2 na crvena krvna zrnca elektronskim mikroskopom, može se vidjeti da ima očigledan učinak na membranu ljudskih crvenih krvnih zrnaca, ali nema očigledan učinak na crvena krvna zrnca koze.Ovaj PLA2 ima očigledan retardirajući efekat na elektroforetsku brzinu crvenih krvnih zrnaca kod ljudi, koza, zečeva i zamoraca.Chen et al.Ovaj enzim može inhibirati agregaciju trombocita izazvanu ADP, kolagenom i natrijum arahidonskom kiselinom.Kada je koncentracija PLA2 10/xg/ml~100jug/ml, agregacija trombocita je potpuno inhibirana.Ako su isprane trombocite korištene kao materijal, PLA2 ne bi mogao inhibirati agregaciju u koncentraciji od 20Mg/ml.Aspirin je inhibitor ciklooksigenaze, koji može inhibirati učinak PLA2 na trombocite.PLA2 može inhibirati agregaciju trombocita hidrolizom arahidonske kiseline kako bi se sintetizirao tromboksan A2.Konformacija otopine PLA2 koju proizvodi otrov Agkistrodon halys Pallas u provinciji Zhejiang proučavana je pomoću kružnog dihroizma, fluorescencije i UV apsorpcije.Eksperimentalni rezultati su pokazali da je konformacija glavnog lanca ovog enzima slična onoj iste vrste enzima iz drugih vrsta i rodova, konformacija skeleta ima dobru otpornost na toplinu, a strukturna promjena u kiseloj sredini je reverzibilna.Kombinacija aktivatora Ca2+ i enzima ne utiče na okruženje ostataka triptofana, dok inhibitor Zn2+ čini suprotno.Način na koji pH vrijednost otopine utječe na aktivnost enzima razlikuje se od gore navedenih reagensa.
U procesu PLA2 prečišćavanja zmijskog otrova, očigledan fenomen je da zmijski otrov sadrži dva ili više PLA2 elucijskih vrhova.Ovaj fenomen se može objasniti na sljedeći način: ① zbog postojanja izoenzima;② Jedna vrsta PLA2 je polimerizovana u različite PLA2 mješavine s različitim molekularnim težinama, od kojih je većina u rasponu od 9 000~40 000;③ Kombinacija PLA2 i drugih komponenti zmijskog otrova komplikuje PLA2;④ Budući da je amidna veza u PLA2 hidrolizirana, naboj se mijenja.① I ② su uobičajeni, sa samo nekoliko izuzetaka, kao što je PLA2 u CrWa/w zmijskom otrovu
Postoje dvije situacije: ① i ②.Treće stanje je pronađeno u PLA2 u otrovu sljedećih zmija: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestinska poskoka, pješčana zmija i strašna zvečarka km。
Rezultat slučaja ④ dovodi do promjene brzine migracije PLA2 tokom elektroforeze, ali se sastav aminokiselina ne mijenja.Peptidi se mogu razbiti hidrolizom, ali općenito su i dalje povezani disulfidnim vezama.Otrov zvečarke istočne jame sadrži dva oblika PLA2, koji se nazivaju tip a i tip p PLA2.Razlika između ova dva tipa PLA2 je samo jedna aminokiselina, odnosno glutamin u jednom PLA2 molekulu je zamijenjen glutaminskom kiselinom u drugom PLA2 molekulu.Iako tačan razlog za ovu razliku nije jasan, općenito se vjeruje da je povezana s deaminacijom PLA2.Ako se PLA2 u otrovu palestinske zmije održava toplim sa sirovim otrovom, krajnje grupe u njegovim molekulima enzima će postati više nego prije.Iz C PLA2 izolovan iz zmijskog otrova ima dva različita N-terminala, a njegova molekularna težina je 30000. Ovaj fenomen može biti uzrokovan asimetričnim dimerom PLA2, koji je sličan simetričnom dimeru koji formira PLA2 u otrovu istočne dijamantske zvečarke. i zapadna dijamantska zvečarka.Azijska kobra se sastoji od mnogih podvrsta, od kojih neke nisu baš određene u klasifikaciji.Na primjer, ono što se nekada zvalo podvrsta Cobra Outer Caspian sada je prepoznata
Trebalo bi ga pripisati kobri iz vanjskog Kaspijskog mora.Kako postoji mnogo podvrsta i pomiješane su, sastav zmijskog otrova uvelike varira zbog različitih izvora, a visok je i sadržaj PLA2 izoenzima.Na primjer, otrov kobre
Najmanje 9 vrsta PLA2 izoenzima r ^ ll vrsta je pronađeno u, a 7 vrsta PLA2 izoenzima pronađeno je u otrovu kobre podvrste Caspian.Durkin et al.(1981) proučavali su sadržaj PLA2 i broj izozima u različitim zmijskim otrovima, uključujući 18 otrova kobre, 3 otrova mambe, 5 otrova poskoka, 16 otrova čegrtuše i 3 otrova morske zmije.Općenito, PLA2 aktivnost otrova kobre je visoka, s mnogo izoenzima.PLA2 aktivnost i izozimi otrova zmije su srednje.PLA2 aktivnost otrova mambe i otrova zvečarke je vrlo niska ili nema PLA2 aktivnosti.PLA2 aktivnost otrova morske zmije je također niska.
Posljednjih godina nije prijavljeno da PLA2 u zmijskom otrovu postoji u obliku aktivnog dimera, kao što je istočna rombofora zvečarke (otrov C. zmije sadrži tip a i tip P PLA2, od kojih su oba sastavljena od dvije identične podjedinice , a ima samo dimeraza
Aktivnost.Shen et al.također je predložio da je samo dimer PLA2 zmijskog otrova aktivni oblik enzima.Proučavanje prostorne strukture također dokazuje da PLA2 zapadne dijamantske zvečarke postoji u obliku dimera.Ribolovno jedinjenje
Postoje dva različita PLA ^ Ei i E2 zmijskog otrova, u kojima 仏 postoji u obliku dimera, dimer je aktivan, a njegov disocirani monomer je neaktivan.Lu Yinghua i dr.(1980) dalje su proučavali fizička i hemijska svojstva i kinetiku reakcije E. Jayanthija et al.(1989) izolovao je osnovni PLA2 (VRVPL-V) iz otrova zmije.Molekularna težina monomera PLA2 je 10000, koji ima smrtonosne, antikoagulantne i edemske efekte.Enzim može polimerizirati polimere različite molekularne težine pod uvjetom PH 4,8, a stepen polimerizacije i molekulska težina polimera rastu s porastom temperature.Molekularna težina polimera generiranog na 96 °C je 53 100, a PLA2 aktivnost ovog polimera se povećava za dva
Vrijeme objave: 18.11.2022